HPLC에 의한 아데닌과 카페인의 분리 - 결과보고서

2026-00000 김새결

Data & Results(결과)

#1. 아데닌과 카페인의 분리

HPLC에서 Retention time(RT)은 시료를 inject한 시점부터 원하는 특정 성분이 검출기에 도달할 때까지 걸리는 시간을 말한다. 크로마토그램에서는 peak가 나타날 때의 시간이 RT와 동일하다. 그래프에서 흡광도[mAbs]의 의미는 흡광도를 밀리 단위로 표현했다는 뜻이다.

[표 ] 아데닌 용액과 카페인 용액의 크로마토그램 분석 결과

성분

retention time[분]

300𝜇M 아데닌

1.84

500𝜇M 카페인

2.6567

Blank(증류수:메탄올=60:40(v/v))

1.94

2.9267

아데닌의 RT는 1.84분이고, 카페인의 RT는 2.6567분이다. 아데닌의 RT가 카페인보다 짧은데, 이는 아데닌이 카페인보다 고정상과의 상호작용이 더 약하다는 것을 의미한다.

#2. 아데닌과 카페인의 흡수 스펙트럼

아데닌 1mL와 카페인 1mL를 섞은 1:1의 Mix sample을 제작하여 250nm, 260nm, 270nm, 280nm에서 크로마토그램을 얻었다.

[표 ] Mix sample의 파장별 크로마토그램 분석 결과

아데닌

카페인

파장

RT[분]

최대흡광도[mAbs]

RT[분]

최대흡광도[mAbs]

250nm

1.7534

565.8886

2.67

193.3035

260nm

1.7567

782.9048

2.6833

363.1725

270nm

1.77

574.3132

2.6967

569.4167

280nm

1.7633

119.7472

2.69

507.755

Mix sample은 아데닌과 카페인으로 이루어져 있기 때문에 각 그래프에 나타난 두 peak 값이 아데닌과 카페인에 기반한 것임을 알 수 있고, 실험 1에서 구한 (아데닌의 RT)=1.84분, (카페인의 RT)=2.6567분을 바탕으로 첫 번째 peak를 아데닌, 두 번째 peak를 카페인으로 분석할 수 있다. RT값의 오차율을 분석해보면,

<아데닌> 250nm: 4.7%, 260nm: 4.5%, 270nm: 3.8%, 280nm: 4.1%

<카페인> 250nm: 0.5%, 260nm: 1.0%, 270nm: 1.5%, 280nm: 1.3%

와 같이 나온다.

아데닌은 260nm에서 최대 흡광도 중 가장 높은 값을 기록했고, 카페인은 270nm에서 최대 흡광도 중 가장 높은 값을 기록했다.

#3. 커피에 들어있는 카페인의 정량분석

<카페인의 농도별 크로마토그램>

[표 ] 카페인의 농도와 크로마토그램 적분값의 관계

카페인 몰 농도

retention time[분]

면적[mV*s]

2.7433

1778.488

2.7733

3403.13

2.8767

4837.546

2.6867

5655.742

retention time: 분, 면적:

1/10로 묽힌 커피의 크로마토그램 적분값을 카페인의 검정곡선식에 대입해 몰농도를 구하면, , , 즉, 1/10로 묽힌 커피의 몰농도는 이다.

따라서 커피 용액의 몰농도는 이고, 카페인의 분자량은 [1] 이므로 커피 용액의 카페인 농도는 이다. 따라서 100mL 커피에 들어있는 카페인의 질량은 이다.

Discussion(고찰) 및 Conclusion(결론)

#1. 아데닌과 카페인의 분리

해당 실험을 통해 HPLC를 이용하여 아데닌, 카페인의 구조 차이에 따른 Retention time의 차이를 알 수 있었다. 아데닌과 카페인의 RT값이 Blank의 RT와 일치하지 않으므로 분석 결과의 피크는 아데닌과 카페인의 성분에 의한 것임을 알 수 있어 이는 실험의 신뢰성을 높여주고, 분석 시 간섭 피크가 발생하지 않았기에 HPLC 분석의 정확성을 보장한다. 실험 결과에 따르면, 아데닌의 RT는 1.84분이고, 카페인의 RT는 2.6567분임을 알 수 있다.

아데닌은 퓨린 고리 구조와 함께 와 같은 극성 작용기를 가지고 있고, 이를 통해 수소 결합을 형성하며 친수성을 증가시킨다[2]. 이는 아데닌이 친수성을 띠는 것을 알 수 있고, 카페인은 메틸기()가 3개 있어 비극성 성질이 아데닌보다 크고 메틸기로 인해 소수성을 띤다[3]. 따라서 아데닌이 카페인보다 상대적으로 높은 극성을 가지고, 상대적으로 친수성 특성을 가져 극성인 이동상에 분배되는 정도가 더 커 카페인보다 RT가 짧게 나타난다. 물은 메탄올보다 극성이 더 높기에, 전개액의 메탄올 퍼센트를 늘렸을 때 이동상의 극성의 정도가 약해져 아데닌의 RT는 길어지고, 카페인의 RT는 짧아질 것이다.

Blank에서 피크가 나타났지만, 모든 흡광도 값이 음수로 나타나는 비정상적인 상황이 일어났는데, 이는 검출기가 blank 성분에 반응하지 않거나, 시스템의 오염을 시사한다. 향후 실험에서는 시스템의 청결도와 검출기의 상태를 점검하고, 나타난 문제를 해결하면 더욱 정확한 분석 결과를 얻을 수 있을 것이다.

#2. 아데닌과 카페인의 흡수 스펙트럼

아데닌과 카페인을 1:1로 섞은 Mix sample의 크로마토그램을 분석한 결과, 아데닌은 260nm, 카페인은 270nm이 최대 흡수 파장이다. 해당 실험에서는 10nm의 단위로 파장을 분석해, 250nm, 260nm, 270nm, 280nm 중 최대 흡수 파장을 결정할 수밖에 없어 정확한 최대 흡수 파장을 구하지 못했다. 이를 보완하기 위해서는, 향후 1nm 또는 5nm 단위로 파장을 조정하여 실험을 진행한다면 최대 흡수 파장을 보다 정확하게 결정할 수 있을 것이다. 또한 아데닌의 경우, RT 오차율이 3.8%에서 4.7% 사이로 나타나 카페인에 비해 실험 1의 값과 다소 차이가 나타났는데, 해당 오차는 실험 과정에서 조금씩 존재했던 시료 주입량의 차이, 컬럼 상태나 분석 조건의 변동에서 기반한 오차라고 추정된다. 이를 보완하기 위해 향후 실험에서는 분석할 시료의 주입량을 정확히 통일하고, 아데닌과 카페인의 비율을 달리하며 두 성분 모두 RT값의 오차가 적은 비율을 기준으로 최대 흡수 파장을 분석한다면 더 정확한 결과를 얻을 수 있을 것이다.

#3. 커피에 들어있는 카페인의 정량분석

흡광도 값과 농도 간의 관계를 이용하여 미지 시료 용액의 농도를 구하기 위해 Beer-Lambert law[4]를 이용하는데, 카페인 용액의 몰 흡광 계수는 모두 같고, 경로 길이도 일치하므로 물질의 몰농도는 흡광도인 피크의 면적에 비례함을 알 수 있다. 이를 활용하여 앞서 농도를 달리하여 카페인의 검정곡선을 그리고, 검정곡선의 수식에 묽힌 커피 용액의 적분값을 대입함으로써 묽힌 커피 용액의 몰농도를 구했다. 또한 카페인의 분자량을 농도에 곱해 커피 1mL당 들어있는 카페인의 질량을 구했다. 검정곡선의 값이 0.9803이 나왔는데, 1에 가까울수록 검정곡선이 데이터를 잘 설명함을 의미하고 있기에 높은 정확도가 나타나 해당 실험의 분석 결과를 신뢰할 수 있음이 드러난다. 또한, 더욱 정확한 검정곡선을 그리기 위해서  카페인 용액 말고도 다른 농도의 크로마토그램을 더 얻는 실험을 진행한다면, 커피 용액에 들어있는 카페인의 양을 더 정확히 정량할 수 있을 것이다.

References(참고문헌)

[1] Institute of Medicine (US) Committee on Military Nutrition Research. Caffeine for the Sustainment of Mental Task Performance: Formulations for Military Operations. Washington (DC): National Academies Press (US); 2001. 2, Pharmacology of Caffeine. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK223808/

[2] Cheng, L. (2016). Role of Hydrogen Bonding in the Formation of Adenine Chains on Cu(110) Surfaces. Materials, 9(12), 1016. https://doi.org/10.3390/ma9121016

[3] Rodak, K., Kokot, I., & Kratz, E. M. (2021). Caffeine as a Factor Influencing the Functioning of the Human Body-Friend or Foe?. Nutrients, 13(9), 3088. https://doi.org/10.3390/nu13093088

[4] Swinehart, D. F. “The Beer-Lambert Law.” Journal of Chemical Education. American Chemical Society (ACS), July 1962. doi:10.1021/ed039p333.

김희준. 일반화학실험. 자유아카데미, 2010. p.55-69

필요한 경우 실험 관련 개념을 간략히 설명합니다.

실험 데이터를 엑셀에 입력하여 그래프를 그리고, 이미지로 저장하여 삽입합니다.

그래프에 제목, x축[단위], y축[단위]을 기재하여야 합니다.

엑셀에서 그래프를 그릴 때 x축, y축 범위는 그래프의 데이터를 가장 잘 보여줄 수 있는 범위로 설정합니다.

표 삽입 시, 표의 제목 및 데이터의 단위를 반드시 작성합니다.

추가 설명이 필요한 경우 표의 내용을 풀어서 설명합니다.

Result에는 간단히 어떠한 현상, 특징을 볼 수 있는지만 적고, 구체적인 분석은 Discussion에 서술합니다.

오차율은

|참값 – 측정값|/참값

을 계산하여 백분율로 나타내면 됩니다.

대부분의 실험에서 이론적인 참값이 존재하므로, 이를 실험값과 비교하여 오차율을 계산해야 합니다. 해당 오차율을 바탕으로 실험 결과와 오차 원인을 분석하고 개선 방법을 생각해볼 수 있습니다.

검정곡선을 다루는 경우, 엑셀 자체 기능으로 R²값 및 함수식을 표기하여 삽입합니다. 특히 R² 값은 discussion에서 데이터의 신뢰도를 평가할 때 반드시 필요한 지표입니다.

그래프에 나타나지 않은 데이터의 경우, 캡션/표 등에 작성하거나 본문에서 추가로 언급할 수 있습니다.

복잡한 계산식의 경우 한글/워드의 수식 기능을 사용하여 작성하는 것이 좋습니다.

g/mol, mM 등의 단위 또한 수식이나 기호로 입력하는 것이 깔끔합니다.

계산 실수가 나오지 않도록 제출 전 검산해보는 것이 좋습니다.

물질의 분자량 등 잘 알려진 값이라도 해당 데이터를 참고한 자료를 작성하시는 것이 좋습니다.

해당 부분에서는 앞서 나열한 데이터를 분석합니다.

Discussion은 연구 결과와 해석을 중심으로 작성하고, conclusion은 discussion에서 분석한 내용을 바탕으로 주요 결과를 간략하게 요약하여 연구의 결론을 제시하면 됩니다.

이론적인 내용을 바탕으로 실험 결과를 분석합니다.

예상과 다른 실험 결과가 나왔다면 예상과 어떻게 다른지, 어떻게 실험을 보완해야 더 정확한 결과가 나올지 적어줍니다. 오차 분석 및 제언은 화학실험 보고서를 적을 때 핵심 파트이며, 오차율의 값과 별개로 보고서에 반드시 포함되어야 합니다.

(따로 지시사항이 없을 경우) 참고문헌 작성 양식은 자유롭게 선택하되, 모두 통일된 양식을 따르도록 합니다.

화학실험1에서 사용하는 교재인 ‘일반화학실험’은 참고한 페이지를 기재하여 작성합니다.